How to Prepare Specimens?

การเตรียม specimen เพื่อส่งตรวจ ต้องมีชื่อ-นามสกุลผู้ป่วยติดอยู่ที่ภาชนะเสมอ  ใบส่งตรวจต้องเขียนข้อมูลที่จำเป็นให้ชัดเจนและครบถ้วน  หากไม่เป็นไปตามนั้น   อาจเป็นเหตุให้เกิดความล่าช้าในการตรวจ     specimen ที่มาจากตำแหน่งต่างกัน  ควรแยกขวดเสมอ  เพื่อป้องกันความสับสนและผลกระทบที่อาจเกิดกับคนไข้    การเตรียม specimen สามารถแบ่งย่อยตามชนิดดังนี้

1.    Surgical specimen สำหรับ routine histopathology:
Surgical specimen หมายถึง specimen ที่มีลักษณะเป็นชิ้นเนื้อ (tissue)  สิ่งที่ต้องคำนึงคือ Fixation ที่เพียงพอ การจะนำชิ้นเนื้อไปผ่านขบวนการเตรียมชิ้นเนื้อที่เรียกว่า “routine histopathology” จะเริ่มต้นจาก fixation คือการป้องกันการเสื่อมสลายและคงสภาพของเนื้อเยื่อและเซลล์ให้ได้มากที่สุด   โดยทั่วไปนิยมใช้ 10% buffered formalin โดยใช้ปริมาตรอย่างน้อย 10 เท่าของ specimen
1.1 ชิ้นเนื้อขนาดเล็ก สามารถแช่ใน 10% buffered formalin ได้เลย เพื่อป้องกันชิ้นเนื้อหายและ fixative แห้ง ขวดบรรจุต้องปิดฝาให้สนิท และปิดทับด้วยเทปกาวอีกชั้น เพื่อป้องกันการรั่วซึมระหว่างขนส่ง หรืออาจใช้ภาชนะบรรจุที่ป้องกันน้ำยารั่ว (โปรดติดต่อบริษัทฯ)
2.2 ชิ้นเนื้อขนาดใหญ่ เนื่องจาก formalin ใช้เวลาในการแทรกซึมเข้าสู่ชิ้นเนื้อในอัตราประมาณ 1 มม.ต่อ 1 ชม.   ดังนั้นการแทรกซืมใน specimen ขนาดใหญ่จะเป็นไปอย่างเชื่องช้า  ทำให้ lesion ส่วนที่อยู่ลึกมีภาวะ autolysis  เพราะfixative  เข้าถึงช้าเกินไป   ผลที่ตามมาคือจะประเมินพยาธิสภาพได้ยาก ความแม่นยำในการวินิจฉัยลดลงไป โปรตีนและดีเอ็นเอเสื่อมสภาพ  และส่งผลต่อการตรวจด้วยเทคนิค immunohisochemistry และ molecular ดังนั้นถ้าเป็น specimen ขนาดใหญ่แพทย์ต้องผ่าเปิดให้ถึงตำแหน่งรอยโรค  เพื่อให้ fixation ในบริเวณที่มีความสำคัญเป็นไปอย่างมีประสิทธิภาพ  ยกตัวอย่างเช่น ลำใส้ใหญ่ต้องได้รับการเปิดตามยาว และล้างอุจจาระออกก่อน,  uterus ต้องได้รับการผ่าเปิด uterine cavity ก่อน  เพื่อให้ endometrium คงสภาพและสามารถตรวจด้วยกล้องจุลทัศน์ได้,  breast ต้องได้รับการผ่าเปิดให้ถึงก้อนก่อนเช่นกัน เช่น mastectomy specimen ให้ผ่าเปิดผ่านจากทางด้านผิวหนังไปถึงก้อนเนื้องอก ควรเปิดเพียง 1รอยมีดและไม่ควรเปิดถึง deep margin ทั้งนี้เพื่อให้พยาธิแพทย์สามารถรายงาน margin ได้อย่างถูกต้อง  หากผ่าเปิดมากกว่า 1 รอย อาจทำให้การรายงานผลresection margin เกิดความคลาดเคลื่อนได้ หากไม่ได้มีการผ่าเปิดเพื่อให้มี fixation ที่เหมาะสม บริษัทฯมีความจำเป็นต้องเพิ่มระยะเวลาการออกผลเพิ่มอีก 1 วัน
2.3 ชิ้นเนื้อที่มีขนาดใหญ่มากเกินกว่าจะใช้ fixative ได้ เช่น ขาจากการผ่า AK amputation สามารถเก็บในตู้เย็น หรือแช่ในถังน้ำแข็ง โดยต้องห่อ specimen ด้วยพลาสติกก่อน เพื่อป้องกัน specimen เปียกน้ำ
2.4 ชิ้นเนื้อที่ต้องการ การรายงาน resected margin ด้วย เช่น breast mass, soft tissue mass และอื่นๆ กรณีเหล่านี้แพทย์ผู้ผ่าตัดต้องระบุด้านของช้ินเนื้อก่อน เช่น superior, inferior, medial หรือ lateral margin    โดยต้องทำมารคกิ้งระบุตำแหน่งบนชิ้นเนื้อ ซึ่งโดยทั่วไปมักจะใช้ไหมผูก (เช่น เส้นยาวเดี่ยว เส้นยาวคู่ เส้นสั้นเดี่ยว และ เส้นสั้นคุ่เป็นต้น)   และจะต้องระบุในใบส่งตรวจด้วยว่าตำแหน่งด้วยไหมลักษณะต่างๆคือด้านใด  การใช้หมึกดำก็เป็นอีกหนึ่งทางเลือก  แต่ต้องพ่นกรดน้ำส้มสายชูทับด้วย  เพื่อให้หมึกติดชิ้นเนื้อแน่น
2.    Frozen section: (ต้องโทรนัดล่วงหน้าเสมอ) ให้ส่งชิ้นเนื้อในรูป fresh tissue โดยสามารถขนส่งที่อุณภูมิห้อง  หากชิ้นเนื้อมีขนาดเล็ก ให้นำผ้าก๊อซชุบ normal saline ห่อไว้ เพื่อกันเนื้อแห้ง
3.    Specimen for electron microscopy: ตัด tissue ให้เล็กประมาณหัวไม้ขีด แล้ว แช่ใน 4% glutaraldehyde  แล้วแช่น้ำยาในตู้เย็น อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ทั้งนี้ 4% glutaraldehyde ต้องแช่อยู่ในตู้เย็นทั้งก่อนและหลังใส่ชิ้นเนื้อ
4.    Kidney core biopsy, muscle biopsy, nerve biopsy:  (ต้องโทรนัดล่วงหน้า) ให้ส่งชิ้นเนื้อในรูป fresh tissue  แช่ใน normal saline   การส่งตรวจ EM แนะนะให้ขอ 4% glutaraldehyde จากบริษัทฯสำหรับ fix tissue เป็นครั้งๆไป และต้องตัด tissue ให้เล็กประมาณหัวไม้ขีดก่อนแช่  (โปรดอ่านวิธีการจัดส่งด้วย)
5.    Smears for cytopathology:
5.1 สำหรับการตรวจด้วยเทคนิคนี้สไลด์ส่วนใหญ่จะย้อมด้วย pap stain    เมื่อทำสเมียร์เสร็จผู้ทำสเมียร์ต้องจุ่มสไลด์ลงใน 95% alcohol โดยทันที (ห้ามให้สไลด์แห้ง เพราะจะทำให้เกิด air drying artifact แปลผลได้จำกัดมาก) จากนั้นนำส่งตรวจทั้งที่แช่ใน 95% alcohol  แต่หากมีความลำบากในการขนส่งหรือเกรงว่าจะรั่ว  ให้แช่สไลด์ใน 95% alcohol ทิ้งไว้ 30 นาที จากนั้นสามารถผึ่งให้แห้ง ซึ่งจะให้คุณภาพเซลล์ที่ไม่ต่างกันกับวิธิแรก  ใส่กล่องป้องกันสไลด์แตกและจัดส่งต่อไป
5.2 หากทำสเมียร์ได้หลายแผ่น สามารถแบ่งสเมียร์ 1 แผ่นเพื่อย้อม Wright หรือ Diffquik stain ซึ่งเตรียมได้โดยการผึ่งสไลด์ให้แห้ง (air drying) โดยไม่ต้องใช้ fixative  หากพบว่ามีชิ้นเนื้อหรืออาจมีชิ้นเนื้อติดปลายเข็ม  ให้นำชิ้นเนื้อหรือหัวเข็มนั้นแช่ใน 10% buffered formalin (ใช้ขวดแก้ว ห้ามใช้ขวดพลาสติก  เพื่อกันเข็มเจาะทะลุขวด) เพื่อเตรียมเป็น cell block ซึ่งมีส่วนช่วยในการวินิจฉัยมาก (ไม่มีค่าใช้จ่ายเพิ่มเติม)
6.    Fluid for cytopathology:
เพื่อความสะดวก แนะนำให้นำ fluid จากผู้ป่วย เพื่อส่งตรวจด้วยเทคนิค liquid preparation ซึ่งจะให้คุณภาพเซลล์ที่ดีมาก และช่วยเพิ่มความไวและความแม่นยำในการตรวจ ซึ่งสามารถร้องขอน้ำยาจากบริษัทฯ แต่หากไม่สามารถจัดหาได้ทัน แนะนำให้่ดำเนินการดังนี้

6.1 หากสามารถปั่นและเตรียมเป็นสเมียร์แล้วทำการ fix สไลด์ใน 95% alcohol อย่างน้อย 30 นาที  จากนั้นผึ่งแห้ง จะทำให้ได้สไลด์ที่มีเซลล์ที่คงสภาพดีมากที่สุด  การแปลผลง่ายและแม่นยำกว่า จัดส่งง่ายกว่า
6.2 หากไม่สามารถเตรียมเป็นสเมียร์   ให้เติม 50% alcohol ลงไปใน fluid specimen ในอัตราส่วน 1:1 ปิดฝาให้แน่น  หากไม่ใช่ภาชนะกันรั่ว ให้ทำการพันเทปเพื่อกันรั่วด้วย และจัดส่งต่อไป ทั้งนี้โปรดอย่าใช้ความเข้มข้นและปริมาตร alcohol ที่สูงกว่าที่แนะนำ เนื่องจากจะทำให้เซลล์ตกตะกอนมากเกินไป และลดความไวในการอ่านผล
6.3 แต่หากไม่มี 50% alcohol สามารถใช้ 70% alcohol แทนได้ แต่ต้องใช้ในอัตราส่วนใหม่ โดยอัตราส่วนของ specimen ต่อ 70% alcohol เป็น 2:1  เช่น หากมี CSF 4 ml. ให้เติม 70% alcoholเข้าไป 2 ml. ทั้งนี้โปรดอย่าใช้ความเข้มข้นและปริมาตร alcohol ที่สูงกว่าที่แนะนำ เนื่องจากจะทำให้เซลล์ตกตะกอนมากเกินไป และลดความไวในการอ่านผล

หมายเหตุ: หากสามารถจัดส่งได้ภายในวันเดียว แนะนำให้แช่สารน้ำในตู้เย็น ช่องอุณภูมิ 4 องศาเซลเซียส
7.    Bone marrow and peripheral blood:
7.1 การเตรียมสเมียร์  ให้เตรียม bone marrow aspirate และ peripheral blood smear ด้วยวิธี air drying  หากส่งตรวจ marrow aspirate smear ควรส่งตรวจอย่างน้อย 4 แผ่น เผื่อกรณีสเมียร์ที่ได้รับมีเซลล์น้อย มีการย้อมผิดพลาด และหลายกรณีที่ต้องย้อม iron ด้วย
7.2 การเตรียม bone marrow biopsy ให้แช่ชิ้นเนื้อลงใน 10% buffered formalin หลังทำ imprint โดยทันที เพื่อป้องกันเนื้อแห้ง (สำหรับ bone marrow โปรดติดต่อบริษัทฯเพื่อขอรับ fixative ที่มีประสิทธิภาพดีกว่า 10% buffered formalin)
7.3 การเตรียม bone marrow clot เมื่อแพทย์ดูดได้ bone marrow และพ่นใส่ขวดแล้ว ให้ทิ้งไว้จนกว่า marrow นั้นจะแข็งตัว ห้ามใส่ fixative ก่อน marrow แข็งตัวเด็ดขาด เพราะจะทำให้ marrow นั้นไม่สามารถแข็งตัว และลดความไวในการตรวจเป็นอย่างมาก หรืออาจตรวจไม่ได้เลย เมื่อ marrow แข็งตัวดีแล้ว ให้ใส่ fixative เช่นเดียวกับ bone marrow biopsy (marrow ที่แข็งตัวแล้ว สามารถจะละลาย (เกิดภาวะ clot lysis) ได้เมื่อเวลาผ่านไปพักหนึ่ง) ทั้งนี้ระยะเวลาที่ marrow จะแข็งตัวและละลายนั้น จะแตกต่างกันไปในแต่ละคน ขึ้นอยู่กับโรคที่ผู้ป่วยเป็นด้วย ดังนั้นต้องคอยมั่นสังเกตุเป็นพักๆ
7.4 สำหรับ marrow หรือ peripheral blood ที่จะส่งตรวจ flow cytometry ให้ผสมสารต้านการแข็งตัวของเลือด  โดยอาจจะเป็น heparin หรือ EDTA ก็ได้ และส่งตรวจในอุณหภูมิห้อง
7.5 สำหรับ bone marrow หรือ peripheral blood ที่จะส่งตรวจ cytogenetics ให้ใช้ heparin (ห้ามใช้ EDTA เพราะการตรวจ cytogenetics นั้นต้องตรวจโดยการเพาะเลี้ยงเซลล์ แต่การใช้ EDTA ซึ่งจะดึงแคลเซียมออกจากสิ่งส่งตรวจ และจะทำให้เซลล์ตาย)
7.6 สำหรับ bone marrow หรือ peripheral blood ที่จะส่งตรวจด้วยเทคนิค PCR ต้องใช้ EDTA เท่านั้น เนื่องจาก heparin จะรบกวนกระบวนการ PCR
8. Flow cytometry
การตรวจวิธีนี้ ใช้สำหรับการวินิจฉัยโรคในกลุ่ม leukemia และ lymphoma โดยสิ่งส่งตรวจต้องเป็น fresh sample เท่านั้น อาจจะเป็น peripheral blood, bone marrow, lymph node หรือ tissue อื่นๆก็ได้
8.1 สำหรับ marrow (3 ml) หรือ peripheral blood (5 ml) ที่จะส่ง flow cytometry ให้ผสมสารต้านการแข็งตัวของเลือด โดยอาจจะเป็น heparin หรือ EDTA ก็ได้ โดยเก็บที่อุณหภูมิห้องหรือแช่ที่ตู้เย็นอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส
8.2 สำหรับ lymph node หรือ solid tissue อื่นที่สงสัย lymphoma ให้เก็บแบ่งชิ้นเนื้ออย่างน้อย 5x5x5 mm แช่ใน RPMI หรือ culture media อื่นๆ และทำการแช่ specimen ที่อุณหภูมิ 2-8 องศาเซลเซียส (ระหว่างรอการขนส่ง)
9. Molecular genetics
• การตรวจด้วยเทคนิคอณูพันธุศาสตร์นั้น specimen ที่เหมาะสมที่สุดคือ fresh specimen แต่ทั้งนี้ การตรวจหลายชนิดสามารถใช้ paraffin embedded tissue หรือ tissue ในรูปแบบอื่นๆได้ ซึ่งหากมีข้อสงสัย จะมีการแนะนำเป็นรายๆไป
10. Review (Consultation) case:
• ต้องแนบใบรายงานผลการตรวจทางพยาธิวิทยาจากการตรวจครั้งก่อนๆด้วย หรือหากยังไม่เคยมีการรายงานผลมาก่อน  ให้แนบใบขอส่งตรวจจากสถาบันเดิม  ทั้งนี้เพื่อยืนยันว่าสิ่งส่งตรวจนั้นเป็นของผู้ป่วยรายนั้นจริง นอกจากนี้ผลการวินิจฉัยเดิมยังมีผลต่อการให้ความเห็นของพยาธิแพทย์ด้วย
• ควรส่งสไลด์ที่มีทั้งหมด
• ควรส่งพาราฟินบล็อกมาด้วยเสมอ เมื่อมีการสั่งย้อมเพิ่มเติม จะได้ไม่ทำให้เสียเวลา  นอกจากนี้เคสจำนวนหนึ่งต้องตัดย้อม H&E  ใหม่ เพื่อให้ได้สไลด์ที่มีคุณภาพมากขึ้น ซึ่งจะต้องใช้พาราฟินบล็อกอยู่แล้ว